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> Aufklärung des DNA-Reparatursystems mit Hilfe der Proteomik <
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Die Doktorandin Katja Bärenfaller der Arbeitsgruppe von Prof. Jiricny untersucht das Enzymsystem, welches fehlerhafte DNA-Stränge repariert. Fehler im Aufbau der DNA können entstehen, wenn das Enzym DNA-Polymerase bei der Verdopplung des DNA-Stranges einzelne Basen falsch eingefügt. Die Proteine des Reparatursystems erkennen solche Fehler und korrigieren sie sofort.
Im Englischen bezeichnet man diesen Reparaturprozess als 'Postreplicative Mismatch Repair' oder einfach ‚Mismatch Repair' (MMR). Die Bezeichnung ‚Postreplicative' bedeutet, dass es sich um eine Fehlerkorrektur handelt, die unmittelbar nach der DNA-Replikation (DNA-Verdopplung) eingeleitet wird.
Katja Bärenfaller möchte herausfinden, welche Proteine an diesem Reparaturprozess beteiligt sind, und was ihre Funktionen sind. Es geht demnach in einem ersten Schritt um die Analyse der Zusammensetzung eines komplizierten Proteingemisches. Eine solche Analyse beschäftigte in den Achtzigerjahren noch ganze Forschergruppen über Jahre hinweg. Dank der modernen Massenspektrometrie und der heute verfügbaren Genomsequenzen der entsprechenden Organismen kann eine einzige Person innerhalb weniger Monate die Proteine eines solchen Systems identifizieren.
Katja Bärenfaller verwendet für ihre Untersuchungen selber hergestellte, fehlerhafte DNA. Es handelt sich dabei um einen DNA-Doppelstrang, bei welchem der eine Strang an einer Stelle eine Base zuviel hat. Das verleiht dem Doppelstrang einen so genannten ‚Knick', weil sich die beiden Stränge nicht glatt aneinander anfügen können. An diesen Knick binden nun die Reparaturproteine des Zellextrakts. Alle übrigen Proteine bleiben ungebunden in Lösung. Um die spezifisch gebundenen Reparaturproteine von allen anderen Proteinen abzutrennen, bindet Katja Bärenfaller die fehlerhafte DNA zuerst an ein metallhaltiges Molekül. Mit Hilfe eines Magneten (Magetischer Partikelkonzentrator - siehe Bild oben) lassen sich die DNA-Stücke dann mitsamt der anhaftenden Reparatur-Proteine an der Wand des Versuchsgefässes festhalten. Der Rest der Probe mit allen übrigen Proteinen, die nicht zum Reparatursystem gehören, kann einfach mit einer Pippette entfernt werden.
Das isolierte Proteingemisch enthält jetzt praktisch nur noch die Proteine des Reparatursystems. Dies sind aber immer noch zu viele, um sie direkt im Massenspektrometer untersuchen zu können. Mit Hilfe der ICAT(Isotop Coded Affinity Tag)-Technologie reduziert Katja Bärenfaller deshalb die Komplexität des Gemischs, bevor sie es weiter untersucht. Gleichzeitig kann sie mit dieser Methode auch die Proteinmengen verschiedener Proben relativ zueinander bestimmen.
Das Proteingemisch wird zuerst mit einer Protease, dem Verdauungsenzym Trypsin, in kurze Aminosäureketten (Peptide) zerschnitten. Bei der ICAT-Technologie gibt man nun ein Reagenz zu dem Peptidgemisch, das sich nur an die Cystein-Bausteine der Ketten bindet. Alle Peptide, die kein Cystein enthalten, bleiben ungebunden und können daraufhin mit einem speziellen Verfahren abgetrennt werden. Nach dem Abtrennen dieser Fragmente bleibt nur ca. 1 Prozent der ursprünglichen Peptidmenge zurück. Die Aminosäuresequenzen der Cystein-haltigen Peptide können nun mit dem
Massenspektrometer
analysiert werden.
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